محلول رویی خارج شد و پس از اینکه اتانول کاملاً تبخیر شد رسوب در مقدار مناسبی از TE حل گردید.
۲-۳-۲ تعیین غلظت نمونه‌های DNA توسط دستگاه Nanodrop
از ان جایی‌که روش DNA Typing دارای دقت و حساسیت بالایی است، بنابراین نمونه‌های DNA باید دارای کیفیت مطلوبی باشند. در این مطالعه جهت تعیین غلظت نمونه‌های DNA، از دستگاه نانودراپ c۲۰۰۰ استفاده شد. حین استفاده از این دستگاه، نیازی به رقیق سازی نمونه‌های DNA نمی‌باشد. ابتدا دستگاه را با بهره گرفتن از کنترل فاقد DNA (آب مقطر یا TE) صفر نموده، سپس ۲ میکرولیتر از نمونه‌ی DNA را با بهره گرفتن از سمپلر در دستگاه قرار داده شد تا میزان جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۲۸۰/۲۶۰ و ۲۳۰/۲۶۰ اندازه‌گیری شود. به طور کلی اسید‌های نوکلئیک در طول موج ۲۶۰ نانومتر و پروتئین‌ها در طول موج ۲۸۰ نانومتر بیشترین میزان جذب نوری را دارند. از نسبت جذب نمونه در طول موج ۲۶۰ به ۲۸۰ نانومتر جهت تعیین خلوص DNA و جهت بررسی حضور دترجنت‌هایی مانند SDS، کربوهیدرات، کلروفرم و فنل از نسبت جذب در طول موج ۲۶۰ به ۲۳۰ نانومتر استفاده شد. برای داشتن نمونه‌هایی با کیفیت مطلوب، عدد حاصل از نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ باید ۸/۱ یا بیشتر باشد. میزان جذب پایین‌تر از ۷/۱ نشان دهنده‌ی آلودگی نمونه‌ها با پروتئین است.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۳-۳ تهیه‌ی Working Stoke
برای انجام واکنش DNA Typing ، غلظت مناسب از نمونه‌های مورد آزمایش تهیه گردید. در این مطالعه از DNA با غلظت ng/µl70 استفاده شد.
شکل ۲-۱ تصویر دستگاه نانودراپ c2000(51)
۲-۴ تست DNA Typing
روشی که امروزه برای تعیین هویت افراد در آزمایشگاه‌های سراسر جهان انجام می‌شود روشDNA Typing است. در این روش از توالی‏های کوتاه تکراری استفاده می‌شود. نشان‌گرهای STR به آسانی قابل تکثیر هستند و به واسطه طول کوتاه امکان تکثیر هم‌زمان آنها از طریق PCR چندتایی وجود دارد. در این روش از بیش از یک جفت پرایمر در مخلوط واکنش PCR استفاده می شود و بنابراین منجر به تکثیر هم‌زمان دو یا چند ناحیه از DNA می شود. قابلیت انجام PCR چندتایی روی مارکرهای STR بدین معنی است که کمترین مقدار DNA (1/0 تا ۱ نانوگرم) حتی DNA شکسته شده نیز با موفقیت قابل الگویابی (تایپینگ) می‌باشد.
۲-۴-۱ Multiplex PCR
نوعی واکنش PCR است که به منظور تکثیر از نواحی مختلف ژنوم در یک واکنش به کار می‌رود. در این فرایندDNA ژنومی با بهره گرفتن از پرایمرهای مختلف، با یک DNA پلی‌مراز و درجه‏ی حرارت حدواسط برای تمامی پرایمرها تکثیر می شود. این تکنیک نخستین بار برای بررسی حذف ها در ژن دیستروفین به کار گرفته شد. در سال ۲۰۰۸ از این تکنیک برای آنالیز میکرو ستلایتها و SNP ها استفاده شد. در واقع این PCR شامل چندین مجموعه پرایمر است که داخل یک مخلوط واحدPCR هستند و قادر به تکثیر توالی‏های مختلف DNA با اندازه‏های مختلف می باشند. با هدف قرار دادن چندین ژن در آن واحد، اطلاعات بسیار بیشتری نسبت به یک PCR عادی به دست می‌آید. در واقع مزیت این روش صرفه جوئی در مواد و زمان است. نکته حائز اهمیت در این روش دمای اتصال پرایمرها است که باید به طور دقیق محاسبه شوند تا به درستی در واکنش عمل کنند. هم چنین طول جفت بازهای آنها باید به اندازه‌ای با هم متفاوت باشد که باندها از طریق الکتروفورز از یکدیگر قابل شناسایی باشند. در حال حاضر از کیت‏های تجاری بسیاری در آزمایشگاه‏های سراسر جهان به منظور تکثیر چندگانه DNAاستفاده می‏شود.

شکل۲-۲ استفاده از Multiplex PCR در روش پروفایلینگ(۳۶)
۲-۵ مواد و تجهیزات مورد نیاز در DNA Typing
۱- کیت AmpFlSTR Identifiler تهیه شده از شرکت ABI که حاوی مواد زیر است:
– PCR Reaction Mix (Mgcl_2، دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات و سرم گاوی حاوی آلبومین در بافر سدیم آزاید ۰۵/۰)
– سری پرایمرها( حاوی پرایمرهای نشاندار شده با فلورسنت)
– آنزیم Taq پلی‌مراز
Allelic ladder –
۲- آب مقطر دیونیزه
۳- نمونه‏های DNA
۴-دستگاه heated lid thermocycler مدل GeneAmp® PCR System 9700
۲-۵-۱ آزمایش DNA Typing
واکنش PCR
برای بررسی شانزده جایگاهSTR موردنظر از Multiplex PCR استفاده شد. ابتدا PCR master mix با اضافه نمودن مواد ذیل به ازای هر واکنش تهیه شد:
– میکس واکنش μL 5/10
– آنزیم Taq پلی‌مراز μL 5 /0
– پرایمرها μL 5/5
در نهایت به هر لوله واکنش μL 15 از master mix اضافه شد.
برای هر واکنش μL 1 DNA با غلظت ng 7 به کار گرفته شد. سپس نمونه‏ها در دستگاه ترموسایکلر با برنامه زیرقرار داده شد.
جدول ۲-۴ شرایط PCR

مرحله آخر

گسترش نهایی

گسترش

اتصال

دناتوراسیون

مرحله آغاز

۱سیکل

۱سیکل

۲۸ سیکل

۱سیکل