کوربو و همکاران (۲۰۰۸) اثر بعضی ترکیبات طبیعی (تیمول، کارواکرول، عصاره چای سبز، عصاره رزماری، دانه گریپ فروت و عصاره لیمو) و بسته بندی با اتمسفر اصلاح شده را بر کنترل جمعیت باکتری های عامل فساد ماهی را در گوشت ماهی بررسی کردند. در این مطالعه اثر تیمول با غلظت های مختلف (ppm 10000-500) در محیط برون تنی (in vitro) بر روی باکتری های اصلی فساد ماهی (شوانلا پوتریفاسینس^[۵۰] و ﻓﺘﻮ ﺑﺎﮐﺘﺮﯾﻮم ﻓﺴﻔﻮرﯾﻮم^[۵۱]) بررسی شد.
طبق نتایج بدست آمده عصاره ی لیمو و تیمول در ترکیب با بسته بندی با اتمسفر اصلاح شده بیشترین فعالیت مهاری را از خود نشان دادند. تیمول در کنترل رشد باکتری های عامل فساد ماهی موثر است و بطور مشخص با P<0.05 باعث کاهش جمعیت باکتریایی نسبت به گروه کنترل شد(۳۷).
لاهوجی و همکاران (۲۰۱۰) اثر اسانس های آویشن شیرازی و مرزه و مواد تیمول و کارواکرول بر فوزوباکتریوم گرامیناروم^[۵۲] و داکسی نیوالنول^[۵۳] را بررسی کردند. طبق نتایج بدست آمده از این بررسی نتایج این بررسی نشان داد که اسانس ها و مواد مذکور دارای فعالیت قارچ ایستایی و بازدارندگی از تولید داکسی نیوالنول هستند .غلظت لازم برای بازداری کامل از رشد جدایه های مورد استفاده در صد میلی لیتر محیط کشت PDA^[54] به ترتیب برای اسانس های آویشن شیرازی و مرزه برابر ۱۶ و ۵/۳۱ میکرولیتر و برای مواد تیمول و کارواکرول ۷۰ و ۱۵ میکرولیتر برآورد گردید. غلظت مذکور در محیط مایع PDB^[55] برای آویشن شیرازی و مرزه به ترتیب ۱۶ و ۳۰ و برای تیمول و کارواکرول به ترتیب ۷۰ و ۲۰ میکرولیتر بود .میزان داکسی نیوالنول تولید شده در محیط مایع حاوی تیمارهای آویشن شیرازی، مرزه، تیمول و کارواکرول به ترتیب ۸۴، ۱/۸۹، ۹۵ و ۶/۸۶ درصد نسبت به شاهد بدون اسانس کاهش یافت. هم چنین در هر میلی گرم ماده خشک میسلیوم در شاهد و تیمارهای تیمول، کارواکرول، آویشن و مرزه به ترتیب ۹/۳۵۳، ۹/۱۷، ۵/۲۷، ۶/۹۲ و ۲/۹۴ نانوگرم داکسی نیوالنول ردیابی گردید، که این نتایج گویای تاثیر مستقیم اسانس ها و مواد مؤثر مورد مصرف بر ساختار داکسی نیوالنول بود(۳۸).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

«فصل دوم»
مواد و روشها
۲- فصل دوم: مواد و روش‌ها
در این مطالعه تاثیر تیمول، نایسین و اسید لاکتیک بر روی لیستریا مونوسایتوژنز تلقیح شده به نمونه های سینه مرغ طی نگهداری در یخچال در زمان های مختلف به تنهایی و حالت های ترکیبی در هشت گروه مورد بررسی قرارگرفت.
گروه بندی آزمایش ها به شرح زیر بود:
گروه I: تیمار با غلظت mg/ml 04/0 تیمول
گروه II: تیمار با غلظت/ml gμ ۶ نایسین
گروه :III تیمار با اسید لاکتیک ۲%
گروه IV: تیمار با تیمول mg/ml 04/0 و نایسین /ml gμ ۶
گروه V: تیمار با تیمول mg/ml 04/0 و اسید لاکتیک ۲%
گروه VI: تیمار با نایسین/ml gμ ۶ و اسید لاکتیک ۲%
گروه VII: تیمار با تیمول mg/ml04/0 و نایسین/ml gμ ۶ و اسید لاکتیک ۲%
گروه :VIII تیمار با آب مقطر استریل به عنوان گروه کنترل
۲-۱- تعیینMIC^[56] نایسین و تیمول
MIC نایسین و تیمول و به روش میکروپلیت^[۵۷] تعیین شد. رقت مورد نظر برای تیمار از رقت های پایین تر از MIC انتخاب شد. مراحل تعیین MIC به شرح ذیل بود:
در این مطالعه از نایسین ۵/۲% (SIGMA^®) استفاده شد. برای تعیین MIC نایسین، ۰۲/۰ گرم نایسین به ۵ میلی لیتر اسید کلریدریک ۰۲/۰ مولار اضافه شد و به مدت هفت دقیقه در دمای C˚۸۰ حرارت داده شد. ماده ی حاصل از فیلتر سرنگی استریل (Biofil, 0.45 µm) عبور داده شد، سپس با بهره گرفتن از آب مقطر استریل از این ماده رقت های سریالی تهیه شد.
جهت آماده سازی تیمول، میزان ۰۱/۰ گرم تیمول (SIGMA-ALDRICH^®) با ۱ میلی لیتر Tween 80 (MERCK-Schuchardt) مخلوط شد. ماده ی حاصل از فیلتر سرنگی استریل عبور داده شد، سپس با بهره گرفتن از آب مقطر استریل از این ماده رقت های سریالی تهیه شد.
جهت تعیین MIC از میکروپلیت های ۹۶ خانه ای استفاده شد. به این صورت که در هر چاهک میکروپلیت ۹۶ خانه ای، µl20 از رقت های تهیه شده از محلول نایسین، µl20 از سوسپانسیون باکتری دارای ۱۰^۶ باکتری در هر میلی لیتر و lµ ۱۶۰ از محیط کشت براث ریخته شد. میکروپلیت به مدت ۲۴ ساعت در دمای C˚۳۰ گرمخانه گذاری شد و سپس نتایج قرائت گردید. برای تعیین MIC تیمول نیز طبق همین روش عمل شد.
MIC نایسین برابر با/ml gμ ۵/۱۲ و MIC تیمول mg/ml156/0 تعیین شد.
۲-۲- آماده سازی وسایل
کلیه ی وسایل مورد نیاز شامل سر سمپلر ها، لوله‌های آزمایش، بشرها، آب مقطر، محیط کشت پالکام^[۵۸](Merck KGaA) و پیپت ها قبل از شروع به کار اتوکلاو شدند و زیپ لاک ها، آبپاش و کاغذ های صافی توسطuv استریل شدند. تیمول، نایسین و اسید لاکتیک با بهره گرفتن از فیلترهای سرنگی استریل شدند.
۲-۳- تهیه ی سوسپانسیون باکتری
باکتری لیستریا مونوسایتوژنز مورد استفاده در این مطالعه از سویه رفرانس موجود در گروه بهداشت مواد غذایی و آبزیان (۷۶۴۴ :ATCC) تهیه شد.
برای تهیه ی کشت با بهره گرفتن از آنس استریل و در شرایط استریل از سویه رفرانس برداشته و بر روی پلیت های حاوی محیط BHI آگار کشت داده شد. پلیت به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری گردید.
جهت تهیه ی سوسپانسیون باکتری از کلنی های حاصل از کشت ۲۴ ساعته توسط آنس استریل برداشته شد و در لوله های حاوی آب مقطر استریل انتقال داده شد. تعداد باکتری با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفوتومتر از طریق کدورت سنجی مطابق با لوله ۵/۰ مک فارلند در نظر گرفته شد (میزان جذب نوری برابر با ۱۳۳/۰ در طول موج ۶۰۰ نانومتر). در این کدورت تعداد ۱۰^۸ ×۵/۱ باکتری در میلی لیتر موجود بود. برای انجام هر مرحله از آزمایش به میزان
مورد نظر از سوسپانسیون باکتری تهیه شده برداشت شد و سوسپانسیون باکتریایی جهت تلقیح با تعداد ۱۰^۶ باکتری در هر میلی لیتر تهیه شد.
۲-۴- ضدعفونی کردن قطعات مرغ
قطعات مرغ (سینه ی مرغ)^[۵۹] پس از انتقال به آزمایشگاه، ابتدا بصورت قطعاتی با ابعاد حدودی ۲ ×۵ ×۵ سانتی متر و به وزن تقریبی ۵۰ گرم آماده سازی شدند.
جهت ضدعفونی، قطعات مرغ ابتدا با بهره گرفتن از آب شرب کاملا شستشو داده شدند، سپس به مدت ۳۰ دقیقه با بهره گرفتن از محلول نانوسیل ^[۶۰](نانوسیل فارم^® ، گروه دارو سازی کیمیا فام) ۳% ضد عفونی شدند و در نهایت با بهره گرفتن از پنس استریل از محلول حاوی نانوسیل خارج شدند و نمونه ها دو بار در بشر حاوی آب مقطر استریل غوطه ور شدند. سپس نمونه ها مجددا با آب مقطر استریل به صورت اسپری شست و شو داده شدند تا محلول نانوسیل به خوبی از سطح قطعات مرغ شسته شده و سپس بر روی پلیت استریل خشک شدند. هدف از ضدعفونی کردن قطعات سینه کاهش تعداد باکتری سطح نمونه به حداقل ممکن بود.
۲-۵- تلقیح باکتری به نمونه ها
در مرحله بعد نمونه ها به سوسپانسیون باکتری منتقل شدند و بعد از ۳۰ دقیقه نمونه ها خارج شدند و به صورت مجزا به مدت ۲۰ دقیقه داخل پلیتهای استریل دارای کاغذ صافی استریل قرار داده شدند تا اتصال^[۶۱] باکتری به سطح نمونه ها صورت بگیرد.
۲-۶- تیمار^[۶۲] نمونه ها
نمونه ها پس از تلقیح باکتری، تحت تیمار با غلظت های معین اسید لاکتیک، تیمول، نایسین و حالات ترکیبی آن ها طبق گروه بندی تعیین شده قرار گرفتند. سپس نمونه های تیمار شده در بسته بندی های استریل قرار گرفته و در یخچال نگهداری شدند. نمونه ها(در دو تکرار) در روزهای صفر (بلافاصله پس از تلقیح)، ۳ و ۷ از یخچال خارج شدند و در این مرحله ابتدا به میزان ۲۵ گرم از هر نمونه بصورت استریل جدا شد و به همراه ۲۲۵ میلی لیتر محلول رقیق کننده (آب پپتونه استریل ۱/۰%) با بهره گرفتن از دستگاه بگ میکسر^[۶۳] (interscience France) به سوسپانسیون تبدیل شدند.
تصویر شماره ۲- ۱: دستگاه بگ میگسر
در مرحله بعد از سوسپانسیون حاصل از هر نمونه به میزان لازم برداشت شد و پس از رقت سازی در دو پلیت (Duplicate) در محیط اختصاصی پالکام (Merck KGaA) کشت داده شدند و برای مدت ۲۴ ساعت در دمای C˚۳۰ گرمخانه گذاری شدند. کلنی های رشد یافته پس از طی مرحله انکوباسیون شمارش شده و تعداد باکتری ها مطابق با روش های استاندارد میکروبیولوژی مواد غذایی بر مبنای تعداد باکتری در هر گرم محاسبه و ثبت گردید.
تصویر شماره ۲- ۲: رشد باکتری لیستریا مونوسایتوژنز روی محیط کشت Palcam
۲-۷- آنالیز آماری
آنالیز آماری میانگین، انحراف معیار، مینیمم، ماکسیمم تعداد باکتری در گروه های مختلف در روزهای مختلف انجام گردید. روند تغییرات لگاریتم تعداد باکتری در گروه های مختلف در دوره ۷ روزه توسط آزمون آماریRepeated measure ANOVA مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. مقایسه ۲ تایی گروه ها توسط تست Bonferroni انجام شد. کلیه آنالیز های آماری توسط نرم افزار SPSS نسخه ۱۶ انجام شد.
«فصل سوم»
نتایج
۳- فصل سوم: نتایج
۳-۱- توصیف رشد باکتری لیستریا مونوسایتوژنز تحت تاثیر اسید لاکتیک، نایسین، تیمول و حالتهای ترکیبی آنها در دوره ی مطالعه.
میانگین، انحراف معیار، مینیمم و ماکزیمم لگاریتم تعداد باکتری در گروه های مختلف پس از تیمار در جداول شماره ۳-۱ و ۳-۲ آمده است:
جدول شماره ۳- ۱: جدول میانگین، انحراف معیار، مینیمم وماکزیمم لگاریم تعداد باکتری در گروه کنترل، اسیدلاکتیک، نایسین و تیمول